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外周神经再生的新机制：成纤维细胞与雪旺氏细胞的相互作用

段锴铮^*

复旦大学神经生物学研究所，上海 200032

摘要

外周神经系统与中枢神经系统不同，在受到严重损伤以后还具有很强的再生能力。神经断裂后，在两个残端之间形成空隙，新形成的组织会在这个空隙搭桥。再生的神经轴突沿着这个“神经桥”生长，从邻近端到达远端并最终到达靶器官。英国伦敦大学学院的Alison Lloyd研究组首次揭示了再生过程的分子机制，不仅对发展新的治疗神经损伤的方法提供了可能，也加深了对干细胞和组织发育的基本规律的认识。
该研究组利用荧光显微镜技术，观察了大鼠神经纤维切断后的修复过程。他们发现成纤维细胞在损伤处与雪旺氏细胞接触，前者通过Ephrin/Eph~Sox2~N-cadherin信号通路调控雪旺氏细胞的聚集成簇，形成细索，引导再生的神经纤维穿过伤口。这项新成果发表在最近的《细胞》杂志上[1]。基于其重要的学术意义，《自然》杂志对该成果进行了专门的评述[2]。
这里简要地介绍该研究的主要结果：用免疫荧光法对完全切断的大鼠坐骨神经的损伤部位的神经轴突、胶质细胞(雪旺氏细胞)和成纤维细胞进行染色，观察了损伤后第2至7天的形态变化。雪旺氏细胞在第5天，从两个神经残端开始向“神经桥”迁移并形成不连续的细胞带，而再生的神经轴突从邻近端紧紧跟随着雪旺氏细胞的迁移路径进入“神经桥”。到第7天，整个“神经桥”被雪旺氏细胞带和新生轴突填充并到达远端。特别是在这些雪旺氏细胞的周围聚集了大量的具有组织修复功能的成纤维细胞。研究者进一步将注意力聚集在“神经桥”附近的这两种细胞是否存在相互作用的可能性方面。活细胞成像结果表明，成纤维细胞与雪旺氏细胞共培养后，雪旺氏细胞由原来的相互排斥改变为相互吸引，从而聚集成簇。这揭示了成纤维细胞能改变雪旺氏细胞的活动行为。这两种细胞是通过哪种分子途径产生相互作用的？他们提出了三种假设：(1)由成纤维细胞释放的水溶性分子介导；(2)由成纤维细胞释放的胞外基质成分介导；(3)细胞之间的直接作用。为此，他们巧妙地设计了三种细胞培养方法用以验证，并最终证明了成纤维细胞与雪旺氏细胞是通过细胞直接接触产生的相互作用。
已知Ephrin/Eph信号通路是细胞接触依赖的细胞分选的主要调质。成纤维细胞与雪旺氏细胞密切接触是否通过Ephrin/Eph信号通路发挥作用呢？研究者利用抗体识别了在与成纤维细胞共培养的雪旺氏细胞中有大量磷酸化的Eph受体。另外，RT-PCR结果表明成纤维细胞表达较高水平的EphrinB2配体，而雪旺氏细胞表达较高水平的EphB2受体。进一步应用EphB2融合蛋白和siRNA干扰片段两种方法阻断Ephrin/Eph信号通路后，两种细胞的相互作用被抑制。这些结果说明Ephrin/Eph信号通路调控了成纤维细胞和雪旺氏细胞的细胞分选。该研究还利用一种“条纹分析”(Stripe assays)技术，证明了附着EphrinB2重组蛋白的条纹能够影响培养的雪旺氏细胞的生长位置及大鼠背根节(DRG)神经元的轴突生长方向。
雪旺氏细胞之间的粘连现象提示了其细胞表面的粘连分子可能发生了变化。有报道N-cadherin蛋白在发育过程中表达，而在成年神经中表达下调。但是当神经损伤后，去分化的雪旺氏细胞重新表达这种蛋白。他们利用免疫荧光的方法，观察到与成纤维细胞共培养的雪旺氏细胞大量表达N-cadherin蛋白，并且集中表达在雪旺氏细胞之间的粘连处。用siRNA干扰片段阻断N-cadherin的表达，阻断雪旺氏细胞成簇的形成，而用腺病毒转染过量表达N-cadherin，可以直接产生雪旺氏细胞的成簇现象。另外，研究者又用相似的方法，证明了EphB2信号通路是通过转录因子Sox2来实现对N-cadherin的调控。大鼠坐骨神经切断后第5天的切片染色结果表明：“神经桥”附近去分化的雪旺氏细胞表达EphB2、N-cadherin、Sox2全部三种蛋白。这些结果明确地表明成纤维细胞通过Ephrin/Eph~Sox2~N-cadherin信号通路调控雪旺氏细胞形成簇群，从而介导神经的再生。
进一步在整体实验中利用药理学方法和基因敲除动物，对EphB2信号通路在神经再生中的作用进行了验证。损伤后第4天，冰冻切片染色结果表明：与正常对照的再生神经纤维相比，被阻断EphB2信号或EphB2基因缺失动物的神经再生明显地被干扰，再生神经纤维的走向杂乱无章。
该研究合理地选择实验模型和技术方法，深入研究了新现象产生的机制，有创新性发现。实验设计的严谨，体现在每个细节上，例如：用多种抗体、多种药物和多种技术手段来验证同一个靶点；从在体和离体多个角度来证明同一现象等等。笔者从精读该文章中受到很大启发，故推荐给广大读者，希望对大家有所裨益。

外周神经再生的新机制：成纤维细胞与雪旺氏细胞的相互作用

段锴铮^*

复旦大学神经生物学研究所，上海 200032

Abstract

外周神经系统与中枢神经系统不同，在受到严重损伤以后还具有很强的再生能力。神经断裂后，在两个残端之间形成空隙，新形成的组织会在这个空隙搭桥。再生的神经轴突沿着这个“神经桥”生长，从邻近端到达远端并最终到达靶器官。英国伦敦大学学院的Alison Lloyd研究组首次揭示了再生过程的分子机制，不仅对发展新的治疗神经损伤的方法提供了可能，也加深了对干细胞和组织发育的基本规律的认识。
该研究组利用荧光显微镜技术，观察了大鼠神经纤维切断后的修复过程。他们发现成纤维细胞在损伤处与雪旺氏细胞接触，前者通过Ephrin/Eph~Sox2~N-cadherin信号通路调控雪旺氏细胞的聚集成簇，形成细索，引导再生的神经纤维穿过伤口。这项新成果发表在最近的《细胞》杂志上[1]。基于其重要的学术意义，《自然》杂志对该成果进行了专门的评述[2]。
这里简要地介绍该研究的主要结果：用免疫荧光法对完全切断的大鼠坐骨神经的损伤部位的神经轴突、胶质细胞(雪旺氏细胞)和成纤维细胞进行染色，观察了损伤后第2至7天的形态变化。雪旺氏细胞在第5天，从两个神经残端开始向“神经桥”迁移并形成不连续的细胞带，而再生的神经轴突从邻近端紧紧跟随着雪旺氏细胞的迁移路径进入“神经桥”。到第7天，整个“神经桥”被雪旺氏细胞带和新生轴突填充并到达远端。特别是在这些雪旺氏细胞的周围聚集了大量的具有组织修复功能的成纤维细胞。研究者进一步将注意力聚集在“神经桥”附近的这两种细胞是否存在相互作用的可能性方面。活细胞成像结果表明，成纤维细胞与雪旺氏细胞共培养后，雪旺氏细胞由原来的相互排斥改变为相互吸引，从而聚集成簇。这揭示了成纤维细胞能改变雪旺氏细胞的活动行为。这两种细胞是通过哪种分子途径产生相互作用的？他们提出了三种假设：(1)由成纤维细胞释放的水溶性分子介导；(2)由成纤维细胞释放的胞外基质成分介导；(3)细胞之间的直接作用。为此，他们巧妙地设计了三种细胞培养方法用以验证，并最终证明了成纤维细胞与雪旺氏细胞是通过细胞直接接触产生的相互作用。
已知Ephrin/Eph信号通路是细胞接触依赖的细胞分选的主要调质。成纤维细胞与雪旺氏细胞密切接触是否通过Ephrin/Eph信号通路发挥作用呢？研究者利用抗体识别了在与成纤维细胞共培养的雪旺氏细胞中有大量磷酸化的Eph受体。另外，RT-PCR结果表明成纤维细胞表达较高水平的EphrinB2配体，而雪旺氏细胞表达较高水平的EphB2受体。进一步应用EphB2融合蛋白和siRNA干扰片段两种方法阻断Ephrin/Eph信号通路后，两种细胞的相互作用被抑制。这些结果说明Ephrin/Eph信号通路调控了成纤维细胞和雪旺氏细胞的细胞分选。该研究还利用一种“条纹分析”(Stripe assays)技术，证明了附着EphrinB2重组蛋白的条纹能够影响培养的雪旺氏细胞的生长位置及大鼠背根节(DRG)神经元的轴突生长方向。
雪旺氏细胞之间的粘连现象提示了其细胞表面的粘连分子可能发生了变化。有报道N-cadherin蛋白在发育过程中表达，而在成年神经中表达下调。但是当神经损伤后，去分化的雪旺氏细胞重新表达这种蛋白。他们利用免疫荧光的方法，观察到与成纤维细胞共培养的雪旺氏细胞大量表达N-cadherin蛋白，并且集中表达在雪旺氏细胞之间的粘连处。用siRNA干扰片段阻断N-cadherin的表达，阻断雪旺氏细胞成簇的形成，而用腺病毒转染过量表达N-cadherin，可以直接产生雪旺氏细胞的成簇现象。另外，研究者又用相似的方法，证明了EphB2信号通路是通过转录因子Sox2来实现对N-cadherin的调控。大鼠坐骨神经切断后第5天的切片染色结果表明：“神经桥”附近去分化的雪旺氏细胞表达EphB2、N-cadherin、Sox2全部三种蛋白。这些结果明确地表明成纤维细胞通过Ephrin/Eph~Sox2~N-cadherin信号通路调控雪旺氏细胞形成簇群，从而介导神经的再生。
进一步在整体实验中利用药理学方法和基因敲除动物，对EphB2信号通路在神经再生中的作用进行了验证。损伤后第4天，冰冻切片染色结果表明：与正常对照的再生神经纤维相比，被阻断EphB2信号或EphB2基因缺失动物的神经再生明显地被干扰，再生神经纤维的走向杂乱无章。
该研究合理地选择实验模型和技术方法，深入研究了新现象产生的机制，有创新性发现。实验设计的严谨，体现在每个细节上，例如：用多种抗体、多种药物和多种技术手段来验证同一个靶点；从在体和离体多个角度来证明同一现象等等。笔者从精读该文章中受到很大启发，故推荐给广大读者，希望对大家有所裨益。

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通讯作者：段锴铮　　E-mail:

引用本文：

段锴铮. 外周神经再生的新机制：成纤维细胞与雪旺氏细胞的相互作用[J]. 生理学报 2011; 63 (1): 94-95.

段锴铮. 外周神经再生的新机制：成纤维细胞与雪旺氏细胞的相互作用. Acta Physiol Sin 2011; 63 (1): 94-95 (in Chinese with English abstract).