Issue Archive

国产蝮蛇毒液及其神经毒素的研究

徐科^*

中国科学院原上海生理研究所，上海 200031

Abstract

编者按：这是一篇综述性文章，也是生理科学研究史的资料。在上世纪六七十年代，我国学者开展了对大陆各地产蝮蛇的毒液的毒力和毒理学实验研究，提出了我国大陆产蝮蛇咬伤的主要致死原因不是血循(或出血)毒素，而是神经毒素的新论点；鉴定了该神经毒素中所含的主要成分是阻断神经肌肉接头前传递的β-型蛇神经毒素，证明了此毒素是在β-型蛇神经毒素中首次发现的中性毒蛋白，测定了该毒素分子的全氨基酸序列，从而推动了对国产毒蛇毒的研究。
1 国产蝮蛇曾被分类为Agkistrodon halys (Pallas)
毒蛇共分为四个科(family)。在陆地上分布的毒蛇共约200余种，分属于3个科：眼镜蛇科(Elapidae)、蝰蛇科(Viperidae)和响尾蛇科(Crotalidae，或称蝮蛇科)。生活在海洋中的蛇都是毒蛇，被分为一个科，属海蛇科(Hydrophidae)。此外部分无毒蛇(如火赤链蛇)虽也具有毒牙，但它们生在口腔的后方，咬人时不会伤及人的皮肤。虽也有被这类蛇咬伤而致死的例子，但是很罕见。毒蛇的毒液中含有多种有机和无机物质，其中对动物和人体有毒性作用的物质称毒素。蛇毒素通常分为作用于神经系统的神经毒素和作用于血液与循环系统的出血毒素(或称血循毒素)。前者又分为选择地阻遏神经肌肉接头前或后传递的β-型或α-型神经毒素。在我国大陆上分布的毒蛇约20余种，其中属神经毒者，且毒力强和危害较大者有属于眼镜蛇科的、分布在我国南方诸省的银环蛇、金环蛇、眼镜王蛇和眼镜蛇等；属出血毒素和神经毒素的混合毒者有属于蝰蛇科的蝰蛇和属于响尾蛇科的蝮蛇。属出血毒毒素，且毒力强和危害较大者有属于响尾蛇科中的五步蛇(或称尖吻蝮蛇)。
据报道[1]，蝮蛇在我国大陆上的各省都有分布，大连蛇岛上的毒蛇也是蝮蛇。在我国如此广大地区分布的蝮蛇都曾被分类为Agkistrodon halys (Pallas)。蝮蛇毒液的毒力在国产毒蛇的毒液中虽不属于最强的一类，但因为蝮蛇在我国分布的范围最广，数量也最多，所以它给我国居民，特别是北方农民的健康和生产活动带来的危害是比较大的。
2 国产蝮蛇毒液曾被认为是以出血毒素为主兼有神经毒素
在“文革”后期，上海市给中国科学院上海生理研究所(以下简称生理所)下达了研究国产蝮蛇毒的任务。生理所将该任务交给我来执行，我当即愉快地接受了任务，因为早在1955年秋在我陪同前苏联医学科学家代表团访问到广州医学院时，该校的药理学教研组为客人们做了从眼镜蛇取毒液的表演，并介绍说该眼镜蛇是借助其毒液中的神经毒素致人于死地的，从那时起我就萌生了研究蛇神经毒素的念头。接到任务后，我立即组织了研究小组，开始了文献调研，并到各地有关的医院和饲养与研究蛇的单位去进行实地考察。经一段时间的工作后，我得知，在有关国产毒蛇的读物中都介绍说，在我国大陆产蝮蛇，不只属于同一个种，其毒液的性质也都被认为是以出血毒素为主兼有神经毒素的混合毒液。但有的分类学者曾提出过将国产蝮蛇分出几个新种和亚种的建议，同时也有少数对治疗蝮蛇咬伤有经验的医生们认为，被蝮蛇咬伤患者虽有明显的血循障碍症状，但导致患者死亡的原因可能首先是来自神经毒素，因而建议在抢救蝮蛇咬伤的危重病例时，应更加重视对神经症状的处置。他们期望科研单位能开展关于蝮蛇毒的毒理学研究，以澄清疑问。考虑到这些情况，又在文献查阅中未能发现关于分析与研究国产蝮蛇毒的毒理学的文章，故我们认为关于蝮蛇毒液是以出血毒素为主兼有神经毒素的结论应是主要来自临床方面的观察。我们结合自己的专业，决定首先探讨被国产蝮蛇咬伤的主要致死原因问题。
3 国产蝮蛇毒素的实验研究
3.1 证明神经毒素是蝮蛇咬伤的主要致死原因
我们在江浙一带收集到一定数量的蝮蛇毒液，经真空干燥制成干粉，便以之为实验材料对上述问题进行了动物实验的分析研究。共完成了3篇论文，其中第1篇在文革中首先以“神经毒组”的署名，刊登在生理所出版的《科学研究论文及技术总结汇编》(1974)上的第3部分《神经肌肉生理学》中，题目为《蝮蛇毒对神经系统作用的初步研究》。在文革结束后又以“第一研究室蛇毒组”的署名正式发表[2]。在文中以3组动物实验的研究结果探讨了蝮蛇毒中毒引起死亡的主要原因：
(1) 在麻醉条件下打开家兔腹腔，将银质圆盘电极固定在膈肌下表面，以之同时记录膈肌的呼吸性节律放电和心电。在给动物注射致死剂量的蝮蛇毒数小时后，待呼吸完全停止时，尚可见心电继续存在。此时如给动物施加人工呼吸，则心电还可维持较长时间。接着在大鼠上进行了同样的实验，得到了同样的结果。在两种实验动物上得到了相同的结果后，我们又将致死剂量的蝮蛇毒注射到小鼠腹腔内，待呼吸完全停止后，打开胸腔又直接观察到心脏跳动达1 h以上。这组实验结果一致支持了蝮蛇毒液中的神经毒素是导致动物死亡的主要原因的论点。
(2) 为了进一步分析蝮蛇毒中毒引起的呼吸麻痹的机制，我们又在麻醉条件下切开动物(大鼠或家兔)的颈部皮肤，分离出一侧(左)膈神经，将其切断后在中枢端放上一对记录电极记录呼吸中枢的节律性放电(见图1A的上线)，再打开动物腹腔在膈肌的右侧部分(即保持完整膈神经支配侧)的下表面放上记录电极，用来记录膈肌的呼吸性节律收缩的放电(图1A下线)。给动物注射致死量的蝮蛇毒，观察从前述两处纪录的呼吸性节律放电的变化。在此实验例中给大鼠注射毒液7 h后出现了呼吸困难。又在给动物施行人工呼吸的条件下继续记录两处的呼吸放电。待注射毒液8小时后，从膈肌记录的呼吸节律放电完全消失(图1B下线)，即膈肌的呼吸节律性收缩已完全停止，但呼吸中枢仍随人工呼吸的频率持续放电(图1B上线)。如继续给动物施行人工呼吸，则可见不伴随膈肌收缩(图1C下线)的呼吸中枢放电(图1C上线)持续下去。此实验结果又一次证明了，蝮蛇毒中毒导致动物死亡的原因是呼吸麻痹，而不是心脏衰竭。此外，根据在动物呼吸停止后膈神经仍继续发出呼吸性节律放电这一事实判断，呼吸中枢和膈神经的兴奋传导功能都未受到影响。这时如直接刺激膈肌，则仍可引起正常收缩。这又表明，蝮蛇毒中毒引起实验动物的膈肌麻痹是由于神经毒素选择地阻遏了膈神经与膈肌的接头传递所致。
(3) 在离体的青蛙的坐骨神经缝匠肌标本上，我们观察到在蝮蛇毒的作用下，由刺激神经不再引起肌肉收缩后，如分别地直接刺激标本的神经和肌肉，则神经的传导和肌肉的收缩功能都正常。这个实验结果也证实了，蝮蛇毒液中的神经毒素的作用是选择地阻遏神经肌肉接头的传递。
我们的第二篇论文[3]报道了，以生物化学方法从蝮蛇毒液中分离出神经毒素和出血毒毒素两个组分。第三篇论文[4]在小鸡的颈二腹肌标本上又观察到，在蝮蛇毒的作用下出现接头传递的完全阻遏后，由乙酰胆碱(ACh)溶液处理标本所引起的肌肉收缩幅度只是较标本未经蛇毒处理前的对照的变小约1/2。这提示，在蝮蛇毒液中应既含有阻遏神经肌肉接头前传递，又含有阻遏神经接头后传递的神经毒素，即既含β-型又含α-型神经毒素。为了进一步验证这一结果，又在大鼠的膈神经膈肌标本上进行了研究，在蝮蛇毒引起了接头传递完全阻遏之后，用微电极将ACh溶液直接施加于肌肉的终板区，也观察到ACh电位只是幅度较对照的变小约1/2，未见完全消失。
顺便指出，在蝮蛇毒液中含有α-型神经毒素的实验结果如能得到进一步证实，并将其纯化和进行分析研究，则应该既有学术价值，又有一定的实际意义。因为迄今尚未见有关在响尾蛇科蛇毒液中发现α-型神经毒素的报道。
3.2 蝮蛇神经毒素应难以通过血脑屏障
我们从医生们的调研中得知，被蝮蛇(包括在我国大陆各地如新疆地区、吉林省和江浙一带产的蝮蛇)咬伤的患者都伴有复视、呼吸困难和四肢乏力等神经症状。于是，我们通过实验探讨了蝮蛇毒对中枢神经系统的直接作用问题。我们将江浙一带产蝮蛇毒注入家兔脑室内后观察到，动物出现奔跑、嚎叫、流涎和四肢抽搐等症状直至死亡[2,5]。这与向实验动物腹腔和静脉注射蝮蛇毒以及被蝮蛇咬伤患者所出现的症状明显不同。这个简单的实验结果又提示，蝮蛇毒液中所含神经毒素应难以通过血脑屏障，即使通过其首先作用的部位也不应是延脑的呼吸中枢。
上述3篇论文发表后首先引起了某些对治疗蝮蛇咬伤有经验的医生们的注意，如苏州和无锡的几位临床医生曾一道来到我们研究组，希望和我们讨论关于蝮蛇咬伤的致死原因究竟首先是来自出血毒素，还是神经毒素问题。总体说来，苏州的医生们支持前一种观点，即认为首先应是来自出血毒素。记得他们还介绍说，某医学院学报上发表的关于蝮蛇毒的基础研究的论文也持这种观点(作者注：还未能查到出处)；而无锡医生们则支持我们论文中的观点。在座谈中向他们介绍了上述实验后，我们根据文献[2]中的一个实验例为他们做了实验表演，取两只小鼠，同时向腹腔注射了致死剂量的蝮蛇毒，待它们的呼吸完全停止后，打开胸腔，暴露出心脏，还直接观察到心脏跳动尚维持达1 h以上。我们的讲解和实验表演使他们信服。虽然如此我们认为，关于导致被国产蝮蛇咬伤患者的死亡原因究竟是主要来自神经毒素，还是出血毒素问题，直到今天在一些治疗蛇咬伤的医生们中间可能依然未能得到充分澄清。
1987年，美国著名的蛇毒研究学者杜祖健(Tu Anthony T)先生用中文签名赠给我一本他本人撰写的、关于毒蛇与蛇毒研究的日文专著[6]。在书中(p.48)有如下叙述：“蝮蛇咬伤虽未见神经症状，但上海生化(理)所的人们报告了用化学方法从蝮蛇毒分离出神经毒。这提示蝮蛇毒中虽含有神经毒素，因其量甚少(咬伤时由于比神经毒素量更多的其它毒素的强势的表现所致)，故蝮蛇咬伤的致死原因不是来自神经毒素，毋宁认为是由于出血毒素的作用(依铃木友二和岩水贞昭等人的研究)”。该书还明确指出：“在日本被称为蝮蛇者其种名为Agkistrodon halys。此种蝮蛇分布在东起日本，西边越过乌拉尔山脉达里海附近的广大地区”。很显然，按此描述在我国大陆的广大地区分布的蝮蛇都被认为是A halys 。在上述3篇论文中我们虽都明确地指出了所用的实验材料系采自“江浙一带产蝮蛇”，但在外文摘要中却只用了A halys (Pallas)的种名。因此在杜氏看来我国大陆产蝮蛇和日本产的蝮蛇既是同种，那么它们的毒液中的毒素性状也应是相同或相似的，即都应是以出血毒素为主，即使含有神经毒素也应是少量的。但我们注意到在该书的另一处(p.47)描述的一个研究结果，即用日本生产的抗蝮蛇毒血清虽可中和韩国陆上产蝮蛇毒，却不能中和伊朗产蝮蛇毒的现象。这一事实应起码已证实了日本蝮蛇与伊朗产蝮蛇虽属同种，但它们的毒液的抗原性是不同的。这一事实提示，日本产蝮蛇毒液虽只含出血毒素，不含神经毒素，但不能排除分布在伊朗，甚至我国江浙一带产蝮蛇毒液中含有神经毒素的可能。
3.3 国产蝮蛇毒的采集及其毒力的测定
我国学者们鉴于将分布在我国广大地区的蝮蛇统称为A halys已不符合他们所掌握的分类资料，早已开始讨论，甚至提出了关于在国产蝮蛇中划分出新种和亚种问题，如赵尔宓等人就明确提出了将国产蝮蛇进行从新分类，还进一步用聚丙烯酰胺凝胶电泳法比较了各种蝮蛇的电泳特性，认为大致符合他们提出的新分类[7]。现将他们关于国产蝮蛇的新分类及其主要分布地区介绍如下：
日本蝮Agkistrodon blomhoffii (Boie)
短尾亚种 A. b. brevicaudus.Stejneger (采自浙江省或江苏省一带。在辽宁省也有分布)
乌苏里亚种A. b. ussuriensis Emelianov (采自吉林省盘石。在辽宁省也有分布)
中介蝮 A. intermedieus Strauch (采自新疆的新源县)
雪山蝮 A. monticol Werner
黑眉蝮 A. saxatilis Emelianov (分布于吉林省)
高原蝮 A. strauchii Bdriaga
蛇岛蝮 A. shedaoensis Zhao (大连蛇岛)
用自行采集的短尾蝮蛇和新疆产中介蝮蛇的蛇毒干粉和赵氏按上述分类采集的另两种蝮蛇毒液干粉，我们测定了它们的小鼠半数致死量(LD50、静脉注射，mg/kg)，比较了它们毒力强度[5]。测试的结果如下：中介蝮 0.38，乌苏里蝮 0.63，短尾蝮 0.88，蛇岛蝮 0.81。
由于采毒的诸多条件(如季节、采毒时的气温等)的差异可能对毒力的影响，故测定所得的具体数据只能作为对毒力的初步判断。虽然如此从上述结果已可看出，它们的毒力有明显差异：以新疆产中介蝮蛇的毒液的毒力最强，吉林产乌苏里亚种蝮蛇的次之，而江浙产的短尾亚种蝮蛇与大连蛇岛蝮蛇的毒力最弱。
3.4 各种蝮蛇毒液中的神经毒素的毒力测定
由于在青蛙的神经缝匠肌标本上和家兔的整体实验中已证明了短尾亚种蝮蛇毒液中神经毒素的作用是选择地阻断神经肌肉接头传递，此组实验又进一步比较了上述各种毒液中的神经毒素阻遏小鸡颈二腹肌标本的接头传递所需的时间，即测量从施加毒液到刺激标本的神经，不再引起肌肉收缩的时间间隔，用以判断它们的神经毒素的毒力强度[5]。然后再在接头传递阻断后用ACh溶液处理标本的肌肉，观察其ACh敏感性的变化：如不变、完全消失或部分消失，又可判断该神经毒素为阻遏接头前、后传递或兼有前与后作用者[3](见表1)。
上述3种蝮蛇的神经毒素的作用强度的顺序不只与LD50的测定结果是一致的，依实验中所用毒量判断，中介蝮蛇毒液中的神经毒素的毒力较乌苏里蝮蛇的强约5倍，再依传递阻遏时间判断，中介蝮蛇和乌苏里蝮蛇毒液中的神经毒素的毒力又都要强于短尾蝮蛇的。这表明神经毒素在这三种毒液中的相对重要性。但用大剂量的大连蛇岛蝮蛇毒也未能引起接头传递阻遏表明，其中未含有神经毒素。临床资料也提示，被这些蝮蛇咬伤的患着，无论是被新疆产中介蝮蛇或江浙产的短尾亚种蝮蛇咬伤的都伴有明显的神经症状，但被大连蛇岛蝮蛇咬伤的患者无神经症状。无论上述实验结果或临床资料都一致表明，前三种蝮蛇的毒液都是以神经毒素为主兼有出血毒素，但大连蛇岛蝮蛇毒液中只含有出血毒素。
因为新疆产中介蝮蛇毒液的毒力最强，以及在其中又未能观察到α-型神经毒素，故将其分类为独立的中介蝮蛇应是合适的，但赵氏等人将江浙一带产的短尾蝮蛇和吉林省乌苏里蝮蛇分类为日本蝮蛇的亚种不一定是合适的，因为无论两亚种的毒液中的毒素性状和被它们咬伤所引起的临床症状都和日本蝮蛇的有明显的差异。还有将大连蛇岛产蝮蛇列为新种，也值得商榷。因为大连蛇岛蝮蛇咬伤的症状不但和日本蝮蛇的相似，并且在它们的毒液中都只含有出血毒素，两者在分布地域又相距较近，故将我国大连蛇岛蝮蛇分类为新种是否合适 ？这些资料仅供分类学者们参考。
3.5 从短尾蝮蛇毒液纯化的β-型神经毒素
由于收集到足够数量的短尾蝮蛇毒液并制成蛇毒干粉，我们便首先从此种蛇毒中纯化出一个新的被鉴定为选择地阻遏神经肌肉接头前传递的神经毒素，即β- 型神经毒素，将其命名为β-Agkistrodotoxin (β-AgTx，β-蝮蛇毒素)[8]。随后我们又纯化出另一个新的β-神经毒素，命名为β2-AgTx(前者可相应地称为β1-AgTx)[9,10]。两者的分子都是由122个氨基酸残基构成的中性蛋白，也都具有磷脂酶A2 (PLA2)活性。在它们的分子中只有两个氨基酸残基发生了变异，即在β1-AgTx分子中的55(Val)和80(Asn)位的氨基酸残基在β2-AgTx分子中分别由Pro和Trp所取代。但前者的毒性(小鼠的LD50)和PLA2活性分别较后者的高出约7倍和2倍。Karsson (1979)曾指出，所有已知的β-型神经毒素，无论它是从那一科的蛇毒的毒液纯化的、还是它们的分子是由单链的，或由两个或三个亚基构成的，其所具有的毒性都是由具有PLA2活性的碱性蛋白或分子中的具有PLA2活性的碱性亚基负载的[11]。因此β-AgTx是在β-型神经毒素中首次发现的中性毒蛋白。还有当我们用PLA2抑制剂p-Bromophynecyl bromide处理β1-AgTx时，其神经毒素的毒力和PLA2酶活力的减弱速度有明显差异：前者在处理后2 h已基本无毒化，但后者只降低至1/3，待8 h降至1/10[12]。很显然这些资料对探讨β-型神经毒素的毒力中心和PLA2酶活力中心有一定参考意义。关于探讨β-型神经毒素的毒力和PLA2酶活力中心问题，我们在一次国际会议的摘要中曾提出过关于β-AgTx分子的毒性中心的初步设想[13]。随后由中国科学院生物物理所Tang等在测定了ATX(即β-AgTx)分子的晶体结构的基础上又进一步提出了更为具体的关于ATX的毒性中心的设想[14]。
4 几种蝮蛇毒素的分离
4.1 从中介蝮蛇毒液分离神经毒素[14]
用得到的少量蛇毒干粉通过Bio-Gel P-30柱层析将其分成7个峰，其中峰I被鉴定为出血毒素组分，峰II、III和IV为神经毒素组分。此结果表明，中介蝮蛇的毒液是以神经毒素为主，兼含出血毒素的混合毒液。将3个神经毒组分收集在一起，再经数次不同的柱层析纯化出神经毒素I、II 和III。三者的分子理化特性见表2。
上述初步结果提示，这三者也都应是单链的阻遏神经肌肉接头前传递过程的β- 型神经毒素，但并未发现其中该毒液中含有α-型神经毒素。
4.2 乌苏里亚种蝮蛇毒液的分离
张景康等[15]将从吉林磐石采集的少量的乌苏里亚种蝮蛇毒干粉(系赵尔密提供)，通过DEAE-Cellulose柱层析分离分成10个峰，其中峰3、峰4和 峰5为出血毒素组分，峰6、峰7和峰8为神经毒素组分。经小鸡颈二腹肌标本鉴定峰7为β-型毒素，峰6为α-神经毒素。这些资料提示，苏里亚种蝮蛇毒液也和和短尾蝮蛇毒液相同，是以神经毒素为主兼有出血毒素的混合毒液，并且在神经毒素组分中也是既含有β-型，也含有α- 型神经毒素。
4.3 蛇岛蝮蛇毒
张景康等[16]从少量的从大连蛇岛蝮蛇采集的蛇毒干粉(系赵尔密提供)经DEAE-Cellulose 柱层析分离出11个峰，只从中鉴定出几个含出血毒的峰，未发现神经毒的峰。这些出血毒素组分又通过Bio-Gel P-30柱层析法进行了再一次分离，亦未见含神经毒素组分的出现。这提示了大连蛇岛蝮蛇毒液只含出血毒素。
5 小结和建议
(1) 在我国吉林省地区产乌苏里亚种蝮蛇、江苏和浙江等地产短尾亚种蝮蛇毒是以神经毒素为主兼有出血毒素的混合毒。在抢救被这些蝮蛇咬伤的危重患者时应强调对神经症状的处置。已有实验提示，在两者的毒液中都既含β-型，也含α-型神经毒素。由于在文献中尚未见到关于从蝮蛇科毒蛇的毒液中纯化出α-型神经毒素的报道，所以如能从这两种蝮蛇的毒液中纯化出α-型神经毒素将是具有一定的学术与实际意义。
(2) 新疆产中介蝮蛇毒液中只含神经毒素，并且毒力在国产蝮蛇的毒液中是最强的。由于我们已初步从中分离出几种β-型神经毒素，故如能对它们进行进一步的分析研究，将对蛇毒的毒理学研究和抗蛇毒血清的研制都是有意义的。
(3) 大连蛇岛产蝮蛇毒液中与日本蝮蛇的毒液中相同，只含出血毒素。
(4) 从江浙一带产的短尾蝮蛇毒纯化出两个由122个氨基酸残基构成，具有中性PLA2活性的神经毒素，被命名为β-AgTx (或β1-AgTx)和β2-AgTx。这是在毒蛇的β-型神经毒素中首次发现具有中性PLA2活性者。
(5) 在分类上将短尾蝮蛇和乌苏里蝮蛇作为日本蝮蛇的亚种是否合适？因为它们之间的毒液性质明显不同。还有将大连蛇岛蝮蛇分类为独立的新种是否可行？因为其毒液中与日本蝮蛇的毒液中都只含血循毒素，产地也很相近。

Received: 　　Accepted:

Corresponding author: 徐科　　E-mail: 徐 科

Citing This Article：

徐科. 国产蝮蛇毒液及其神经毒素的研究. Acta Physiol Sin 2012; 64 (3): 349-354 (in Chinese with English abstract).